技术文章
TECHNICAL ARTICLES详细介绍
来源与建立背景
形态与生长特征
功能特性
抗体分泌与特异性:稳定分泌 IgG2a 型单克隆抗体,分泌量达 40μg/10⁶细胞 / 天(ST-2014S 无抗体分泌功能);通过 Western blot 验证,仅与 PCV2 Cap 蛋白(28kDa)特异性结合,与 PCV1、PRRSV 等病毒无交叉反应,与 PCV2 不同亚型(a/b/c/d)的交叉识别率达 99%,显著优于多克隆抗体。
抗原识别表位:识别 Cap 蛋白的构象表位(第 130-150 位氨基酸),该区域为 PCV2 衣壳蛋白的中和抗体结合位点,与病毒粒子的结合率达 95%(ST-2014S 感染的 PCV2 验证);竞争实验证实,4H11 抗体可阻断 PCV2 对 ST-2014S 细胞的吸附(抑制率达 80%),具备中和活性。
免疫学检测性能:在间接 ELISA 中,抗体效价达 1:256000,检测 PCV2 的线性范围 0.1-100ng/mL;在免疫荧光实验中,与 ST-2014S 感染的 PCV2 共定位率达 98%,荧光强度是多克隆抗体的 3 倍,适合病毒定位与定量分析。
PCV2 检测与诊断技术开发
ELISA 检测试剂盒:以 4H11 抗体为捕获抗体构建双抗夹心 ELISA,检测 ST-2014S 培养的 PCV2 灵敏度达 0.1ng/mL,批内变异系数<4%,与猪血清中 PCV2 的检出符合率达 96%(传统方法为 82%)。该试剂盒已实现产业化,使 PCV2 检测时间从 48 小时缩短至 2 小时,基层兽医站普及率达 60%。
免疫组织化学诊断:在 PCV2 相关疾病(如断奶仔猪多系统衰竭综合征)病理切片中,4H11 抗体可特异性标记病毒抗原,阳性信号主要定位于淋巴结与肾脏(与 ST-2014S 的病毒增殖规律一致),阳性强度与疾病严重程度正相关(R²=0.93),为临床分型提供依据。
PCV2 疫苗研发与质量控制
疫苗效价评估:作为 PCV2 疫苗效价检测的标准抗体,4H11 可通过中和实验测定疫苗的保护力,与 ST-2014S 细胞配合使用,中和抗体效价与仔猪攻毒保护率的相关性达 95%(传统方法为 75%),被农业部列为疫苗批签发强制检测方法。
疫苗生产监控:在 ST-2014S 细胞的 PCV2 疫苗生产中,4H11 抗体用于监测病毒增殖动态,可精准确定收获时间(病毒滴度达 10⁷.⁵ TCID₅₀/mL 时),较经验性收获提高疫苗产量 20%,降低生产成本 15%。
PCV2 感染机制研究
病毒入侵路径解析:利用 4H11 抗体的中和活性,发现 PCV2 通过与 ST-2014S 细胞表面的硫酸乙酰肝素结合入侵(阻断后入侵率下降 75%),且该过程依赖细胞内吞(与网格蛋白共定位率达 85%),揭示 PCV2 的宿主细胞入侵机制,研究结果与在体实验一致性达 90%。
病毒变异监测:通过 4H11 抗体与不同 PCV2 分离株的结合力测定,发现 2018 年后流行的 d 亚型 Cap 蛋白第 145 位氨基酸突变可使结合力下降 30%,提示疫苗株需针对性更新,该发现已指导 3 家疫苗企业完成毒株升级。
基础培养方案
培养基:RPMI-1640 培养基添加 10% 胎牛血清、1% 非必需氨基酸,pH 维持在 7.2-7.4;为提高抗体产量,可添加 5ng/mL IL-6(ST-2014S 无需此添加),使分泌量提升 25%,适合大规模培养。
传代与放大:当细胞密度达 1×10⁶个 /mL 时,按 1:5 比例稀释传代(无需离心),24 小时存活率超 95%;放大培养采用摇瓶悬浮培养,5L 摇瓶最大细胞密度可达 2×10⁶个 /mL,抗体总产量是 ST-2014S 培养的 10 倍(按单位体积计)。
冻存与复苏:采用含 15% DMSO 的wan全培养基,细胞密度 5×10⁶个 /mL,程序降温至 - 80℃过夜后转入液氮,复苏时 37℃水浴 1 分钟,存活率可达 90%,需通过 ELISA 验证抗体效价(应≥1:128000)。
抗体纯化与应用操作
抗体纯化:采用 Protein G 亲和层析柱纯化,纯度达 99%,内毒素含量<0.05EU/mg,适合体内中和实验;纯化抗体在 4℃可稳定保存 6 个月,-20℃保存 2 年活性无显著下降。
病毒中和实验:在 ST-2014S 细胞中,4H11 抗体(10μg/mL)可使 PCV2 的 TCID₅₀下降 10⁴倍,中和效价测定的变异系数<6%,适合疫苗中和抗体滴度检测。
优势:
特异性与灵敏度卓yue:是目前 PCV2 检测的金标准抗体细胞系,与 ST-2014S 配合使用可实现病毒 “增殖 - 检测" 全流程标准化,较传统方法准确率提升 30%。
功能多样性:兼具检测与中和活性,既可用于诊断试剂开发,又能研究病毒入侵机制,应用范围覆盖 PCV2 研究全链条,价值远超普通检测工具。
产业化适应性强:抗体分泌稳定,可通过大规模悬浮培养生产,成本仅为进口抗体的 1/5,已实现国产替代,市场zhan有率达 75%。
局限性:
病毒型别局限:对 PCV3 的交叉反应率<5%,需单独开发 PCV3 特异性细胞系(ST-2014S 对 PCV3 同样敏感性低)。
依赖配套细胞系:自身无法增殖病毒,需与 ST-2014S 等病毒宿主细胞配合使用,增加实验复杂性。
种属限制:鼠源抗体用于体内实验可能引发免疫反应,需通过基因工程人源化改造(目前已完成人源化抗体构建)。
4H11 细胞系的建立推动了 PCV2 防控技术的标准化,其开发的检测试剂盒使我国 PCV2 阳性检出率从 65% 提升至 92%。未来,通过基因编辑技术构建双特异性抗体细胞系(同时识别 PCV2 与 PRRSV),可实现多病毒联合检测;结合 ST-2014S 的悬浮培养技术,有望开发 “病毒增殖 - 抗体检测" 一体化芯片。作为 PCV2 研究的核心工具,4H11 与 ST-2014S 形成 “抗体 - 细胞" 协同体系,共同支撑猪圆环病毒病的精准防控与研究。
以上信息仅供参考,详细信息请联系我们。
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