hTERT-NBSC新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系
hTERT-NBSC新生牛睾丸支持细胞永生化细胞系作为牛源生殖细胞研究的突破性模型，以其稳定表达的人端粒酶逆转录酶（hTERT）和长期保留的生精支持功能，在牛精子发生机制解析、生殖细胞体外培养及永生化调控研究中具有不可替代的地位。与 NBS 原代新生牛睾丸支持细胞系的有限传代特性不同，该细胞系通过基因工程改造实现永生化，为探索支持细胞的长期生理功能提供了稳定实验载体。
细胞起源与生物学特性
该细胞系源自 NBS 原代新生牛睾丸支持细胞，通过慢病毒介导的 hTERT 基因转染获得永生化细胞株，经 FSH 受体（FSHR）免疫荧光筛选（阳性率＞98%）及端粒长度检测（维持在 8-10kb）纯化建立。其核心特征是保留支持细胞表型与永生化特性：雄激素结合蛋白（ABP）分泌量达 42ng/(10⁶细胞・24h)，与原代 NBS 细胞的一致性达 96%；hTERT 蛋白表达量稳定（Western blot 灰度值是原代细胞的 5.8 倍），连续传代 100 次后仍保持 75% 以上的生精支持功能，而原代 NBS 细胞传代 20 次后功能下降至 30%。
细胞形态呈现典型的支持细胞星形特征：胞体直径约 19-23μm，较原代 NBS 细胞略大，胞质突起更丰富（长度 35-50μm），细胞核呈不规则形（核质比约 1:2.7），排列呈网状连接，与原代细胞形态吻合度达 95%。培养体系需兼顾永生化与功能稳定性：含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基（添加 5ng/mL FSH 和 2μg/mL 嘌呤霉素），在 37℃、5% CO₂环境下贴壁生长，倍增时间约 48-52 小时（原代 NBS 细胞为 54-58 小时）。传代需在细胞融合度达 75% 时进行，采用 1:3 比例接种，去除嘌呤霉素筛选会导致 hTERT 表达量下降 40%（传代 10 次后）。
功能验证显示，该细胞系的关键指标优于原代细胞：精原细胞黏附支持率达 88%（原代 NBS 为 89%），血 - 睾屏障模拟度（跨上皮电阻 370Ω・cm²）与原代细胞无显著差异；核型分析显示 60 条染色体稳定（异常率＜3%），无支原体污染；hTERT 转染未影响支持细胞特异性基因表达（FSHR、ABP mRNA 水平与原代细胞比值 0.95-1.05），解决了传统永生化方法导致的功能异化问题。
核心应用领域
长期生精调控机制研究
hTERT-NBSC 细胞系是解析牛精子发生长期调控网络的理想模型。在 FSH 长期刺激实验中，该细胞系表现出稳定的激素应答：连续 30 天处理后，ABP 分泌量维持在原代细胞的 92%，而原代 NBS 细胞在第 15 天即下降至 55%。通过该模型发现，长期激素刺激可诱导支持细胞表观遗传修饰改变 ——H3K27ac 在 ABP 启动子区的富集量增加 2.3 倍，这种持续激活状态在原代细胞中因传代限制无法观察。此外，其对季节性繁殖调控因子的响应更稳定：褪黑素处理后，胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）表达量波动幅度＜8%（原代细胞为 15%），为牛季节性生精机制研究提供了可靠数据。
精原干细胞体外培养平台
在精原干细胞长期培养中，该细胞系的应用价值显著。作为饲养层细胞，可使精原干细胞体外存活时间延长至 120 天（原代 NBS 饲养层为 45 天），且维持 80% 以上的干细胞标志物（PLZF）表达，而原代饲养层在第 45 天时表达率降至 40%。通过该平台发现，支持细胞分泌的外泌体 miRNA-10b 可促进精原干细胞自我更新（增殖率提升 2.1 倍），这一机制在连续传代 50 次的 hTERT-NBSC 细胞中仍保持稳定，而原代细胞传代 15 次后外泌体功能下降 50%。目前，该细胞系已用于牛精原干细胞的基因编辑研究，使阳性克隆获得率提升至 35%（原代饲养层为 18%）。
永生化机制与生殖毒性研究
该细胞系为支持细胞永生化机制研究提供了独te视角。对比 hTERT-NBSC 与原代细胞发现，永生化细胞的端粒酶活性达 32U/μg 蛋白（原代细胞 5.2U/μg），且 p16INK4a 衰老相关基因表达量下降 60%，揭示了 hTERT 通过端粒延长与衰老通路抑制双重作用实现永生化。在生殖毒性检测中，该细胞系对双酚 A 的敏感性与原代细胞一致（IC50=11.8μmol/L），但可通过长期暴露实验（90 天）观察到低剂量（1μmol/L）导致的 ABP 分泌量下降 28%，这种慢性效应在原代细胞中无法评估。与 12F9 杂交瘤细胞系的跨领域协同显示，炎症因子 IL-6 可通过抑制 hTERT 表达加速支持细胞衰老（端粒缩短速率增加 1.8 倍），为炎症与生殖衰退的关联提供新证据。
与其他细胞系的差异及协同
与原代 NBS 细胞相比，hTERT-NBSC 细胞的核心优势在于长期稳定性（传代 100 次 vs 20 次），但短期功能指标略低（ABP 分泌量 42ng vs 45ng）；与 12F9 杂交瘤细胞系相比，两者均为永生化模型，但前者保留体细胞功能，后者专注抗体分泌。在生殖 - 免疫交叉研究中，hTERT-NBSC 细胞与 12F9 细胞的条件培养基共培养显示，触珠蛋白可提升支持细胞的精原细胞支持率 15%，这种协同效应为炎症环境下的生精调控研究提供新方向。
优势与局限性
优势体现在：解决原代支持细胞传代受限难题，实现长期实验设计；功能特性与原代细胞高度一致（相关系数 0.96）；可用于基因编辑等需大量均一细胞的实验。局限性包括：hTERT 过表达可能轻微改变细胞周期（G1 期比例下降 3%）；长期培养需嘌呤霉素筛选（可能影响部分代谢通路）；无法wan全模拟体内睾丸的三维微环境（需类器官技术弥补）。
研究意义与展望
该细胞系的建立突破了牛支持细胞研究的时间限制，目前已被 60% 的动物生殖实验室采用，用于 15 项长期生精调控研究。未来通过 CRISPR 技术实现 hTERT 定点整合（降低随机插入影响），结合 3D 生物打印构建 "支持细胞 - 生殖细胞 - 血管内皮" 复合模型，有望模拟体内生精微环境达 85% 以上（目前为 72%）。作为首ge功能稳定的牛支持细胞永生化模型，它不仅为反刍动物繁殖研究提供长效工具，也为人类生殖细胞体外培养提供了比较医学参考。
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