ES-D3(CRL-1934)小鼠胚胎干细胞系
ES-D3(CRL-1934)小鼠胚胎干细胞系源自 129S2/SvPas 小鼠囊胚内细胞团，是首ge实现稳定传代的小鼠 ES 细胞系，在胚胎发育机制、多能性调控及基因编辑研究中具有里程碑意义，因保留完整的发育全能性和稳定的核型，成为哺乳动物 ES 细胞研究的金标准。
该细胞系呈现典型的胚胎干细胞形态与多能性表型。显微镜下，细胞呈圆形或多边形，紧密排列成集落状生长（集落直径 100-200μm），边缘清晰，单个细胞直径约 12-15μm，核质比ji高（约 0.8），细胞核大而圆，染色质疏松呈细颗粒状，可见 2-4 个明显核仁，核分裂象每 10 个高倍视野 15-20 个，胞质少而嗜碱性，无明显胞质结构。电镜下可见胞质内富含游离核糖体，线粒体呈圆形且嵴少，符合未分化细胞的超微结构特征。免疫表型分析显示，细胞高表达多能性标志物 Oct4（阳性率 99%）、Nanog（98%）和 Sox2（97%），细胞膜表面高表达 SSEA-1（95%），不表达分化标志物 SSEA-3/4，核型分析为正常雌性小鼠核型（40, XX），连续传代 50 次仍保持核型稳定，这一特性显著优于早期建立的其他 ES 细胞系。
体外培养体系的核心是维持其未分化状态。最适培养条件为含 15% 胎牛血清的 DMEM 培养基（添加 2mM 谷an酰胺、0.1mM β- 巯基乙醇），需在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上生长或添加 1000U/mL 白血病抑制因子（LIF），37℃、5% CO₂环境下，传代周期 48 小时，倍增时间 18-20 小时，增殖速率远超成体干细胞。其标志性特征是在无饲养层且缺乏 LIF 的条件下，24 小时内 Oct4 表达下降 30%，48 小时出现自发分化（70% 细胞表达中胚层标志物 Brachyury），证实其多能性维持高度依赖外部信号。集落形成率达 45%（接种 1000 细胞 / 孔形成 45 个集落），显著高于其他 ES 细胞系，冻存采用含 10% DMSO 的wan全培养基，梯度降温后液氮保存，复苏存活率超 85%，复苏后 48 小时需挑取未分化集落传代。
多能性调控机制研究揭示其核心信号网络。LIF 通过激活 STAT3 通路（15 分钟 p-STAT3 升高 8 倍）维持 Oct4 和 Nanog 的持续表达（mRNA 水平分别增加 5 倍和 4 倍），同时抑制分化相关转录因子 GATA6（下降 60%）。BMP4 协同 LIF 作用，通过 Smad1/5 磷酸化（升高 5 倍）促进 Id 蛋白表达，阻断神经外胚层分化（Sox1 表达下降 70%）。Wnt 通路在自我更新中起辅助作用，β-catenin 核积累增加 4 倍，与 Oct4 启动子结合增强其转录活性（2 倍）。与其他干细胞相比，其多能性网络更稳定，单因子（如 Oct4）敲除即可导致wan全分化，证实核心转录因子的相互依赖关系。
三胚层分化潜能研究显示其发育全能性。体外拟胚体（EB）形成实验中，悬浮培养 5 天形成囊性 EB（直径 200μm），10 天贴壁后分化出多种细胞类型：外胚层来源的神经细胞（β-III tubulin⁺，30%）、中胚层来源的心肌细胞（20%）和内胚层来源的内胚层细胞（Sox17⁺，15%）。定向诱导条件下，添加视huang酸可使神经细胞比例升至 60%，激活素 A 处理使内胚层细胞达 50%，BMP4 诱导使中胚层细胞达 45%，分化效率均居 ES 细胞系前列。体内畸胎瘤形成实验中，接种裸鼠皮下 4 周形成包含三胚层组织的肿瘤：神经上皮（外胚层）、软骨（中胚层）和腺体（内胚层），证实其体内发育全能性。
基因编辑应用中，该细胞系是制作基因敲除小鼠的shou选工具。因其具有高效的同源重组效率（约 10⁻⁴），通过正负筛选系统可获得纯合敲除克隆，靶向整合准确率超 80%。将编辑后的 ES 细胞注射入 C57BL/6 囊胚，嵌合体小鼠出生率达 35%，生殖系传递效率 40%，显著高于其他品系 ES 细胞。CRISPR/Cas9 技术应用中，其单链退火效率达 60%，脱靶率＜0.1%，成为功能基因组学研究的核心模型，人类疾病相关基因（如 p53、BRCA1）的敲除研究多以此为基础。
发育生物学研究中，ES-D3 细胞模拟了早期胚胎发生过程。时序表达谱分析显示，分化过程中基因表达模式与小鼠胚胎第 3.5-7.5 天高度吻合：Oct4 在第 0-2 天高表达，Sox2 在第 2-4 天主导，中胚层标志物在第 4-6 天显著上调。通过诱导特定信号通路，可再现原肠运动相关的细胞迁移（通过 Transwell 实验检测迁移率增加 3 倍）和轴建立（左右不对称标志物 Pitx2 表达），为解析胚胎极性形成提供了体外模型。
药物筛选应用中，该细胞系用于评估发育毒性。致畸剂（如沙li度胺）处理后，拟胚体中神经细胞分化比例下降 50%，凋亡细胞增加 4 倍，与体内致畸效应一致。其对信号通路抑制剂高度敏感，MEK 抑制剂可wan全阻断中胚层分化（Brachyury⁺细胞从 40% 降至 5%），为靶向特定胚层的药物研发提供了筛选平台。
核移植研究证实其基因组的全能性。将 ES-D3 细胞核注入去核卵母细胞，重构胚囊胚发育率达 30%，移植后获得克隆小鼠（出生率 2%），虽效率低于体细胞核移植，但证实其基因组未发生不可逆表观遗传修饰，为体细胞核重编程研究提供了对照标准。
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