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详细介绍
来源与构建:该细胞系以 CHO-K1 为亲本,通过慢病毒载体介导将人源 CaSR 全长 cDNA 导入细胞基因组,经嘌呤霉素抗性筛选及单克隆纯化获得稳定株。CaSR 基因由 CMV 启动子驱动表达,结合信号肽优化序列,确保受体正确定位于细胞膜(流式细胞术检测膜定位率>90%),名称中 “CaSR" 直接标识其核心功能蛋白。
形态与增殖:体外培养呈上皮样形态,贴壁生长时呈多角形,排列紧密,悬浮培养可形成松散小聚集体(直径 20-40μm),细胞轮廓清晰,活力长期维持在 91% 以上。37℃、5% CO₂条件下,增殖周期约 30-36 小时,适应含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基,传代 60 次以上仍保持稳定生长速率,CaSR 表达量无明显衰减,冻存复苏后存活率超 88%。
功能特征:该细胞系的核心优势在于 CaSR 的钙浓度响应特性:当 extracellular 钙离子浓度在 0.5-3.0mM 范围内变化时,CaSR 可通过 G 蛋白偶联途径激活下游 IP3/Ca²⁺信号通路,使胞内钙浓度波动幅度达基础值的 3-5 倍(荧光探针 Fura-2 检测);其 EC₅₀(半数有效浓度)为 1.2mM,与人体生理钙浓度范围高度匹配,且对 CaSR 激动剂(如锶离子)、拮抗剂(如 NPS-2143)的响应符合量效关系,功能活性接近内源性 CaSR。
钙代谢调控机制研究
钙敏感受体药物筛选
离子稳态检测模型
贴壁培养操作:
复苏:从液氮取出冻存管,37℃水浴 1-2 分钟解冻,转移至含 10mL 预热培养基(DMEM/F12+10% 胎牛血清 + 2μg/mL 嘌呤霉素)的离心管,1000rpm 离心 5 分钟,重悬后接种至 T25 培养瓶,37℃、5% CO₂培养箱静置培养。
换液:接种 24 小时后首ci换液,去除未贴壁细胞,此后每 48 小时换液一次,维持培养基钙浓度在 1.8mM(生理浓度)。
传代:当细胞融合度达 80%-90% 时,弃培养基,PBS 清洗 2 次,加入 1mL 0.25% yi酶 - EDTA,37℃孵育 2-3 分钟,镜检细胞变圆后加入 4mL 培养基终止消化,1000rpm 离心 5 分钟,按 1:4 比例传代至新培养瓶。
功能实验前处理:
冻存流程:取对数生长期细胞,1000rpm 离心 5 分钟,用冻存液(80% wan全培养基 + 10% 胎牛血清 + 10% DMSO)重悬至 5×10⁶个 /mL,分装至冻存管,程序降温盒 - 80℃过夜,次日转移至液氮保存,保存期可达 5 年以上。
优势:CaSR 表达稳定,钙响应灵敏度高(浓度变化 0.1mM 即可检测到信号);功能实验重复性好(批间变异系数<8%);可同时用于激动剂与拮抗剂筛选,应用范围广;贴壁牢固,适合长时程荧光成像实验。
局限性:作为异源表达系统,缺乏内源性辅助蛋白(如 G 蛋白亚型),部分信号通路与原代细胞存在差异;高浓度钙(>5mM)会抑制细胞增殖,功能实验需严格控制钙浓度范围。
以上信息仅供参考,详细信息请联系我们。
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