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来源与永生化:该细胞系源自中国仓鼠成年肺组织,经原代培养与克隆筛选获得永生化株系,“V79" 命名源自早期克隆编号。原代细胞通过酶解法分离,经 50 代连续传代筛选出增殖稳定的单克隆,永生化过程未引入外源基因,主要依赖体外培养压力实现,全基因组测序显示其与原代肺成纤维细胞遗传相似度>97%,核型分析证实染色体数目为 2n=22,核型稳定性优于多数成纤维细胞系(传代 100 次核型畸变率<2%)。
形态与增殖:体外培养呈典型成纤维样形态,贴壁生长时呈长梭形,胞体细长且胞质伸展明显,细胞排列呈平行或漩涡状;悬浮培养易聚集成团,故以贴壁培养为主。37℃、5% CO₂条件下,增殖周期约 24-28 小时,较 CHL 细胞更短,适应含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基,传代 150 次以上生长速率衰减<10%,自发突变率<1×10⁻⁶,冻存复苏后存活率超 88%。
功能特征:核心优势在于低背景突变与高代谢活性:HGPRT(次黄piao呤鸟piao呤磷酸核糖转移酶)基因自发突变率极低(<5×10⁻⁷),便于基因突变事件的检测;Ⅰ 相代谢酶(如 CYP1A1)表达量较 CHL 细胞高 30%,可直接代谢部分前致突变物,无需额外添加代谢活化系统,符合 OECD 476 基因突变测试指南要求。同时,其对辐射损伤响应灵敏,γ 射线照射后 DNA 双链断裂标志物 γH2AX 焦点形成效率较普通细胞高 25%。
基因突变测试
细胞毒性与代谢研究
辐射生物学效应研究
贴壁培养操作:
复苏:冻存管 37℃水浴 1 分钟解冻,转移至含 10mL 预热培养基(DMEM+10% 胎牛血清)的离心管,1000rpm 离心 5 分钟,重悬后接种至 T75 瓶,37℃、5% CO₂培养,24 小时贴壁率超 90%。
换液:接种 24 小时后首ci换液,去除未贴壁细胞,此后每 2 天换液一次,维持细胞密度在 1×10⁴-5×10⁴个 /cm²(密度过高会降低代谢活性)。
传代:融合度达 70%-80% 时,弃培养基,PBS 清洗 2 次,加 2mL 细胞解离液,37℃孵育 2 分钟,镜检细胞脱落后加 8mL 培养基终止,按 1:5 比例传代,避免过度融合导致形态改变。
基因突变测试流程:
细胞准备:对数期细胞以 2×10⁵个 / 皿接种 100mm 培养皿,培养 24 小时后加入受试物,处理 4-24 小时(依受试物特性调整)。
表达培养:去除受试物,新鲜培养基培养 7-10 天(让突变表型表达),期间每 3 天换液一次。
突变克隆计数:加入选择培养基(含 6 - 硫代鸟piao呤 5μg/mL),培养 10-14 天后计数抗性克隆,计算突变频率(每 10⁶存活细胞的突变克隆数)。
冻存流程:取对数生长期细胞,1000rpm 离心 5 分钟,冻存液(70% DMEM+20% 胎牛血清 + 10% DMSO)重悬至 6×10⁶个 /mL,分装冻存管,程序降温盒 - 80℃过夜后移至液氮,保存期超 5 年,复苏后传代 1-2 次即可用于实验。
优势:自发突变率低(<1×10⁻⁶),基因突变检测准确性高;代谢活性强,可直接代谢多数前致突变物;对辐射与化学诱变剂敏感性高,检测下限低;传代稳定性好,150 代内生物学特性无显著改变;培养周期短,实验效率优于 CHL 细胞。
局限性:成纤维细胞特性限制其在上皮细胞特异性毒性研究中的应用;部分水溶性极差的受试物需添加助溶剂(可能影响代谢活性);长期传代(>180 次)可能出现代谢酶活性下降(约 15%),需定期复苏早期冻存株。
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