L-M(TK-)小鼠结缔组织细胞系
L-M(TK-)小鼠结缔组织细胞系源自 C3H 小鼠的皮下结缔组织，是经 5 - 溴脱氧尿苷筛选获得的胸苷激酶（TK）缺陷型细胞系，在基因重组、病毒增殖及嘧啶代谢研究中具有重要价值，尤其因 TK 缺陷特性成为 HAT 选择系统的理想宿主细胞，为哺乳动物细胞基因编辑技术提供了关键工具。
该细胞系呈现典型的成纤维细胞形态与表型特征。显微镜下，细胞呈长梭形或不规则星形，以贴壁生长为主，排列呈放射状或漩涡状，细胞体积较大（长径 30-50μm），核质比低，细胞核呈椭圆形，染色质呈细颗粒状，可见 1-2 个核仁，核分裂象每 10 个高倍视野 2-3 个，胞质丰富，呈弱嗜碱性，可见细长胞质突起，电镜下可见胞质内富含粗面内质网和游离核糖体，符合结缔组织细胞的超微结构特点。免疫表型分析显示，细胞高表达间叶组织标志物 vimentin（阳性率 98%），流式细胞术检测显示其 vimentin 表达强度显著高于上皮细胞系，而上皮标志物 CK 表达阴性，证实其纯结缔组织来源特性。
体外培养体系中，L-M (TK⁻) 细胞展现出稳定的贴壁增殖能力与du特的代谢缺陷。最适培养条件为含 10% 胎牛血清的 MEM 培养基，在 37℃、5% CO₂环境下，传代周期约 72 小时，倍增时间约 50 小时，与正常成纤维细胞增殖速率接近。其核心特征是胸苷激酶基因（TK1）缺失，导致无法利用外源性胸苷合成 DNA，在含 HAT（次黄piao呤、氨基蝶呤、胸苷）的培养基中无法存活（48 小时死亡率达 100%），而在普通培养基中生长正常，这种选择性存活特性使其成为基因转移实验的理想受体细胞。与野生型 L-M 细胞相比，其在含胸苷类似物（如 5 - 氟脱氧尿苷）的培养基中存活率更高（达 80%，野生型细胞仅 10%），证实其嘧啶代谢途径的du特性。软琼脂克隆形成率约 15%，克隆形态呈不规则扇形，连续传代 60 次后，vimentin 表达及 TK 缺陷特性无明显改变，冻存复苏存活率超 95%。
在基因重组研究中，L-M (TK⁻) 细胞是 HAT 选择系统的经典模型。转染实验显示，将含 TK 基因的重组质粒导入细胞后，仅成功整合外源基因的细胞可在 HAT 培养基中存活，阳性克隆率达 30%，显著高于其他选择系统（如 G418 筛选的阳性率 15%）。这种高效筛选特性使其广泛应用于基因互补实验，通过导入野生型基因可恢复相应表型，例如导入 TK 基因后，细胞在 HAT 培养基中的存活率从 0 提升至 90%，DNA 合成速率恢复至野生型水平的 85%。与其他缺陷型细胞系（如 CHO-K1）相比，其转染效率更高（脂质体转染效率达 40%），适合大规模基因文库筛选。
病毒增殖研究证实其对多种病毒的易感特性。感染实验显示，该细胞可支持单纯疱疹病毒（HSV）、痘苗病毒及小鼠白血病病毒的复制，HSV 感染后 24 小时病毒滴度达 10⁷PFU/mL，显著高于 Vero 细胞（10⁶PFU/mL）。因 TK 缺陷，其对 HSV 的 TK 依赖性突变株更敏感（空斑形成率是野生型病毒的 2 倍），这一特性被用于病毒减毒疫苗的筛选。电镜观察显示，病毒在细胞内可完成完整的复制周期，HSV 感染后可见核内病毒颗粒装配及胞质内出芽过程，与野生型细胞相比，病毒释放效率无明显差异（约 50%）。
嘧啶代谢机制研究揭示其te有的补救途径缺陷。酶活性测定显示，细胞内胸苷激酶活性仅为野生型 L-M 细胞的 1% 以下，导致无法利用外源性胸苷合成脱氧胸苷三磷酸（dTTP），必须依赖从头合成途径（由尿苷酸合成 dTTP）。同位素标记实验证实，¹⁴C - 胸苷掺入 DNA 的量仅为野生型细胞的 0.5%，而 ¹⁴C - 尿苷掺入量增加 20%，补偿了补救途径的缺陷。当从头合成途径被氨基蝶呤阻断（HAT 培养基中），因无法利用胸苷，DNA 合成停滞导致细胞死亡，这一机制是 HAT 筛选的理论基础。与其他嘧啶代谢缺陷细胞系相比，其代谢表型更稳定，无回复突变（突变率＜10⁻⁸）。
在药物筛选应用中，该细胞系是抗代谢药物研究的重要工具。基于其代谢特性，可用于区分药物对从头合成途径与补救途径的抑制作用，例如甲an蝶呤（抑制从头合成）对其 IC50 为 0.1μM，显著低于野生型细胞（IC50 1μM），而胸苷类似物（抑制补救途径）对其 IC50 则显著高于野生型细胞（差异达 10 倍）。在抗病du药物筛选中，其对 HSV 胸苷激酶激活的前体药物（如阿xi洛韦）敏感性较低（IC50 是野生型细胞的 5 倍），可用于评估药物的 TK 依赖性。
基因编辑研究中，L-M (TK⁻) 细胞是同源重组实验的理想模型。CRISPR/Cas9 介导的基因修复实验显示，通过靶向导入 TK 基因，可使 HAT 抗性克隆的同源重组效率达 5×10⁻⁵，显著高于非同源末端连接效率（1×10⁻⁶）。利用该细胞系成功构建了多种基因敲除模型，如敲除 p53 基因后，细胞对辐射的抗性增加 3 倍，证明其在基因功能研究中的价值。与胚胎干细胞相比，其培养更简便，无需饲养层细胞，适合高通量基因编辑实验。
在生物制药应用中，该细胞系可用于生产重组蛋白。转染人干扰素 -β 基因后，细胞分泌量达 500IU/mL・24h，显著高于原代细胞，且蛋白糖基化模式与天然蛋白一致。因无内源性病毒污染，符合生物制品生产的安全标准，已用于多种细胞因子的小规模制备。其贴壁生长特性适合微载体大规模培养，在搅拌式生物反应器中密度可达 1×10⁶细胞 /mL，为工业化生产提供了潜力。
肿瘤转化研究显示，该细胞系保留一定的恶性转化潜能。经甲基胆蒽处理后，细胞形态变为多角形，增殖速率加快（倍增时间缩短至 35 小时），软琼脂克隆形成率提升至 40%，接种裸鼠后成瘤率达 60%，证实其可作为化学致癌剂筛选模型。与其他永生化细胞系相比，其转化表型更易检测，适合早期致癌机制研究。
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