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来源与构建机制:该细胞系源自 Vero 亲本细胞,通过慢病毒介导的基因转染将 IgCD4 表达 cassette 整合入基因组,经嘌呤霉素筛选获得稳定克隆。IgCD4 融合受体的设计使 CD4 胞外域结合病毒 gp120 的亲和力较天然 CD4 提升 2 倍,且 Fc 段增强受体在细胞膜的锚定稳定性(流式检测显示受体阳性率>95%)。全基因组测序证实其染色体数目为 60(近二倍体),与 Vero 亲本遗传相似度>98%,IgCD4 基因整合位点稳定(传代 50 次无漂移)。
形态与增殖:体外培养呈典型上皮样形态,贴壁生长时呈多角形,胞核居中,细胞排列较 Vero E6 更疏松;悬浮培养适应性差,以贴壁生长为主。37℃、5% CO₂条件下,增殖周期约 30-34 小时,适应含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基,传代 50 次以上生长速率衰减<12%,冻存复苏后存活率超 85%,群体倍增时间较普通 Vero 细胞延长约 10%(因外源蛋白表达负荷)。
功能特征:核心优势在于病毒识别的特异性与高效性:IgCD4 受体可特异性结合 HIV-1、SIV 等病毒的包膜蛋白 gp120,介导病毒膜融合效率较普通 Vero 细胞提升 10-15 倍,HIV-1 感染后 48 小时病毒滴度可达 10⁶-10⁷ TCID₅₀/mL(p24 抗原检测)。同时,其保留完整的病毒复制支持系统,可观察到从入侵、逆转录到子代病毒释放的完整周期,且无内源性逆转录病毒污染(经 RT-PCR 验证)。
CD4 依赖型病毒机制研究
抗病du药物筛选与评价
疫苗免疫原性评估
贴壁培养操作:
复苏:冻存管 37℃水浴 1 分钟解冻,转移至含 10mL 预热培养基(DMEM+10% 胎牛血清 + 2μg/mL 嘌呤霉素)的离心管,1000rpm 离心 5 分钟,重悬后接种至 T75 瓶,37℃、5% CO₂培养,24 小时贴壁率超 85%。
换液:接种 48 小时后首ci换液(含嘌呤霉素维持筛选压力),此后每 3 天换液一次,维持细胞密度在 2×10⁴-8×10⁴个 /cm²(密度过高导致受体表达下调)。
传代:融合度达 70% 时,弃培养基,PBS 清洗 2 次,加 2mL 细胞解离液,37℃孵育 2-3 分钟,镜检细胞脱落后加 8mL 培养基终止,按 1:4 比例传代,每 10 代检测一次 IgCD4 表达率(需>90%)。
病毒感染实验流程:
细胞准备:以 1×10⁵个 / 孔接种 24 孔板,培养 24 小时至融合度 60%-70%,感染前用无血清培养基洗涤 2 次。
病毒接种:加入含 HIV-1 的病毒液(MOI=0.1),37℃吸附 2 小时,吸弃病毒液后加含 2% 血清的维持液(不含嘌呤霉素)。
检测时机:感染后 48-72 小时通过 p24 ELISA 或 GFP 荧光(针对报告病毒)定量病毒复制,较普通 Vero 细胞提前 12 小时出现阳性信号。
冻存流程:取对数生长期细胞,1000rpm 离心 5 分钟,冻存液(70% DMEM+20% 胎牛血清 + 10% DMSO+2μg/mL 嘌呤霉素)重悬至 6×10⁶个 /mL,分装冻存管,程序降温盒 - 80℃过夜后移至液氮,保存期超 5 年,复苏后需传代 1 次并检测受体表达(确保功能稳定)。
优势:IgCD4 受体表达稳定(传代 50 次阳性率>90%),对 CD4 依赖型病毒感染效率高(较普通 Vero 提升 10 倍以上);可量化分析病毒 - 受体相互作用,实验重复性好(CV<8%);保留 Vero 细胞的培养优势,易于规模化操作;适用于多种 CD4 依赖型病毒研究(HIV、SIV、HTLV 等)。
局限性:嘌呤霉素长期筛选可能诱导代谢压力(需定期无药培养缓解);对非 CD4 依赖型病毒(如冠状病毒)敏感性低;IgCD4 受体可能改变病毒自然入侵路径(需结合原代细胞验证);高 MOI 感染时易出现细胞融合假象(需通过单轮感染实验排除)。
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