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TECHNICAL ARTICLES详细介绍
来源与克隆背景:该细胞系源自 20 世纪 70 年代分离的非洲绿猴肾原代细胞,通过极限稀释法筛选获得单克隆株(“GL" 代表shen源组织特性)。筛选过程以肠道病毒敏感性为核心指标,未引入外源基因,全基因组测序显示其染色体数目为 60(近二倍体),与非洲绿猴肾原代细胞遗传相似度>97%,核型稳定性在传代 100 次内畸变率<2%,群体均一性优于早期混合株(流式检测 G1 期细胞比例偏差<5%)。
形态与增殖:体外培养呈典型上皮样形态,贴壁生长时呈短梭形或多边形,胞质透亮,细胞排列较 VERO-76 疏松;悬浮培养易聚集成小团(直径 30-50μm),以贴壁培养为主。37℃、5% CO₂条件下,增殖周期约 28-32 小时,适应含 10% 胎牛血清的 MEM 培养基,传代 80 次以上生长速率衰减<10%,冻存复苏后存活率超 87%,无血清驯化后细胞密度可达 3.5×10⁵个 /cm²。
功能特征:核心优势在于肠道病毒受体高表达与复制支持能力:脊髓灰质炎病毒受体(PVR)表达量较普通猴肾细胞高 3 倍(免疫印迹检测),柯萨奇病毒 - 腺病毒受体(CAR)阳性率>90%(流式检测)。感染脊髓灰质炎病毒 Ⅰ 型后 72 小时,病毒滴度可达 10⁷-10⁸ PFU/mL,较 VERO-76 细胞高 1-2 个数量级;感染柯萨奇 B 组病毒后 48 小时,细胞病变(CPE)率达 95%,表现为细胞圆缩、脱落,显著快于其他猴肾细胞系。
肠道病毒分离与鉴定
肠道病毒疫苗研发与生产
抗病du药物筛选与评价
贴壁培养操作:
复苏:冻存管 37℃水浴 1 分钟解冻,转移至含 10mL 预热培养基(MEM+10% 胎牛血清)的离心管,1000rpm 离心 5 分钟,重悬后接种至 T75 瓶,37℃、5% CO₂培养,24 小时贴壁率超 90%。
换液:接种 48 小时后首ci换液,去除代谢废物,此后每 2-3 天换液一次,维持细胞密度在 1×10⁴-6×10⁴个 /cm²(密度过高会降低肠道病毒敏感性)。
传代:融合度达 75% 时,弃培养基,PBS 清洗 2 次,加 2mL 细胞解离液,37℃孵育 2 分钟,镜检细胞脱落后加 8mL 培养基终止,按 1:5 比例传代,避免过度融合导致受体表达下调。
病毒培养流程:
接种准备:将细胞以 1×10⁵个 / 孔接种 24 孔板,培养 24 小时至融合度 70%,接种前用无血清培养基洗涤 2 次。
病毒感染:加入 100μL 系列稀释的肠道病毒液(如脊髓灰质炎病毒悬液),37℃吸附 1 小时,期间每 15 分钟轻摇一次,吸弃病毒液后加含 2% 血清的维持液。
观察与收获:脊髓灰质炎病毒感染后 48-72 小时观察 CPE,待 80% 细胞病变时收获上清,-80℃冻存,通过空斑法或 RT-PCR 测定病毒滴度。
冻存流程:取对数生长期细胞,1000rpm 离心 5 分钟,冻存液(70% MEM+20% 胎牛血清 + 10% DMSO)重悬至 5×10⁶个 /mL,分装冻存管,程序降温盒 - 80℃过夜后移至液氮,保存期超 5 年,复苏后传代 2 次再用于病毒实验(确保受体表达稳定)。
优势:对肠道病毒(尤其脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒)敏感性ji高(滴度较普通猴肾细胞高 1-2 个数量级);遗传背景稳定,实验重复性好(CV<6%);符合 GMP 标准,无内源性病毒污染;可适应无血清培养,便于工业化生产;病毒复制周期短,病变特征典型,易于观察。
局限性:对包膜病毒(如狂犬病毒)敏感性较低;贴壁依赖性强,悬浮培养难度高于 CHO 细胞;长期传代(>100 次)可能出现 PVR 受体表达下调(约 12%);缺乏干扰素合成能力,可能高估药物体内抗病毒效果。
以上信息仅供参考,详细信息请联系我们。
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