hTERT-LSC羔羊睾丸支持细胞永生化细胞系
hTERT-LSC羔羊睾丸支持细胞永生化细胞系作为通过端粒酶逆转录酶（hTERT）介导永生化的特异性细胞模型，在反刍动物生殖发育机制、细胞永生化调控及雄性生殖疾病研究领域具有里程碑式的价值。它的建立突破了原代支持细胞传代有限的瓶颈，为长期追踪羔羊睾丸支持细胞的分化规律、生精微环境稳态维持及永生化相关信号通路研究提供了稳定的体外平台，对揭示反刍动物生殖细胞与支持细胞互作机制及繁育技术创新意义深远。
睾丸支持细胞的体外研究长期受限于原代细胞传代次数少（通常不超过 15 代）、增殖能力随传代逐渐衰退等问题，难以开展长期实验及稳定的功能验证。hTERT 作为调控端粒长度的关键因子，通过导入该基因可使细胞突破增殖极限，实现永生化同时保留原有生物学特性。羔羊阶段的支持细胞处于增殖分化关键期，其永生化细胞系的建立不仅解决了材料获取的局限性，更能精准模拟青春期前睾丸支持细胞的生理状态，为解析反刍动物生殖系统发育的时间依赖性规律提供了独te工具。
hTERT-LSC 细胞系的建立采用严谨的基因编辑与细胞培养技术结合的方案。从健康新生羔羊睾丸组织中分离原代支持细胞，通过免疫磁珠分选（利用 CD90 特异性标志物）获得高纯度细胞群。采用慢病毒载体将 hTERT 基因导入原代细胞，经嘌呤霉素筛选获得稳定表达株。阳性克隆接种于含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养液中，在 37℃、5% CO₂培养箱中培养，每 24 小时换液一次。待细胞汇合度达 80% 时进行传代，目前已连续传代超过 100 代，细胞活力仍保持在 90% 以上，显著优于原代细胞（传代 15 代后活力降至 50% 以下）。
该细胞系保留典型的不规则星形形态，胞体伸展呈多角状，胞质突起丰富且相互连接形成网状结构，细胞核呈圆形居中，核仁清晰可见。与原代 LSC 细胞相比，永生化细胞体积略大，增殖速率提高约 30%，群体倍增时间缩短至 60 小时。核型分析显示，传代 100 代后仍保持羔羊正常染色体数目，hTERT 基因稳定整合于基因组中，端粒长度维持在 5-8kb（原代细胞传代 15 代后端粒缩短至 2kb 以下）。免疫荧光检测证实，细胞高表达波形蛋白、转铁蛋白等支持细胞特异性标志物，且表达水平与原代细胞无显著差异，表明永生化过程未改变其细胞属性。
在功能特性方面，hTERT-LSC 细胞系展现出更稳定的生殖支持功能。ELISA 检测显示，其分泌的雄激素结合蛋白（ABP）浓度稳定在 28ng/mL，显著高于传代后期的原代细胞（12ng/mL），且连续传代 50 代后分泌能力无明显下降。与精原细胞共培养实验表明，该细胞系可使精原细胞存活率提高 45%，促进其向初级精母细胞分化的比例达 30%，效果优于原代细胞且重复性更高。在永生化机制研究中发现，细胞中 PI3K/Akt 信号通路持续激活，p53 抑癌基因表达受到适度抑制，为解析支持细胞永生化的分子网络提供了直接证据。此外，该细胞系对生殖系统病原体如布鲁氏菌的敏感性与原代细胞一致，感染后 24 小时即可观察到典型的细胞病变，适合用于长期感染模型的建立。
hTERT-LSC 细胞系在多个研究领域展现出独te优势。在生殖发育研究中，通过连续传代观察，首ci揭示了羔羊支持细胞在体外长期培养中类固醇合成酶的动态表达规律；在永生化机制研究中，利用该细胞系验证了端粒酶与端粒结合蛋白 TRF2 的协同调控作用；在应用层面，已成功用于绵羊病毒性睾丸炎的药物筛选，筛选出 3 种具有显著保护效果的化合物。该细胞系的建立还为其他反刍动物支持细胞的永生化提供了标准化方案，目前已据此建立了牛、山羊的同源永生化细胞系。
作为首ge稳定传代超过 100 代的羔羊睾丸支持细胞模型，hTERT-LSC 不仅解决了原代细胞研究的局限性，更开创了反刍动物生殖细胞长期体外模拟的新范式。其在保持细胞原有功能特性的同时实现永生化的特点，为生殖生物学基础研究、动物繁育技术创新及男性生殖疾病模型建立提供了跨物种的研究工具，对推动畜牧业可持续发展和人类生殖健康研究具有重要的双向意义。
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