一、关键步骤
组织取材与处理
取材于胃组织肌层，需剥离黏膜、外膜及结缔组织，保留中层环形肌。用含双抗的PBS清洗3次，去除血污及杂质。若怀疑污染，可置于含青链霉素的混合液中浸泡30~60分钟。
组织块剪切与消化
将组织剪成1mm³小块，采用两步消化法：先加0.2%胶原酶-Ⅱ于37℃消化1小时，待组织呈絮状后，再加0.25%胰蛋白酶消化15~30分钟，期间每隔10分钟摇动一次。消化后通过200目滤网过滤，收集滤液。
细胞接种与培养
滤液1000rpm离心5分钟，弃上清，用含15%FBS的DMEM培养基重悬细胞，按5×10⁵cells/瓶接种至T25培养瓶。置于37℃、5%CO₂培养箱中静置培养，每2~3天换液一次。
二、成功率提升策略
优化消化条件
胶原酶与胰蛋白酶联合使用可提高细胞释放效率，但需严格控制消化时间，避免过度消化导致细胞损伤。建议通过显微镜观察组织块边缘细胞游出情况，及时终止消化。
接种密度控制
初始接种密度以5×10⁵cells/瓶为宜，密度过低会导致细胞间促生长信号不足，密度过高则引发营养竞争。传代时按1:2比例分瓶，保证细胞生长空间。
培养环境管理
使用预热的培养基，避免温度波动影响细胞代谢。培养箱需定期校准CO₂浓度（5%）及湿度（95%），防止细胞脱水或酸碱失衡。
污染防控
操作全程在超净工作台内进行，器具需高压灭菌。培养瓶口消毒后开启，避免直接接触瓶口。若发现污染，立即弃用并消毒环境。
细胞纯度鉴定
通过CD31免疫荧光检测细胞纯度，确保目标细胞占比≥90%。定期观察细胞形态，排除成纤维细胞等杂质干扰。
