原代大鼠成肌细胞体外增殖与分化受多重因素调控，其核心机制涉及基因表达、培养条件及细胞间相互作用三大层面。
基因表达调控是分化的根本驱动因素。成肌细胞分化依赖奢侈基因的差异表达，如肌丝蛋白基因的开放促进肌管形成。研究显示，DNA甲基化状态直接影响基因活性，5-氮胞苷处理可诱导去甲基化，改变细胞分化方向。转录水平调控同样关键，转录因子如MyoD、Myf5等通过结合特定DNA序列激活肌细胞分化程序，而细胞周期蛋白（如CyclinA2）的过表达则通过调控细胞周期进程影响增殖与分化平衡。
培养条件优化是体外实验成功的关键。血清浓度是核心变量，高血清（如15%小牛血清）促进增殖，低血清（如2%马血清）诱导分化。细胞密度显著影响分化效率，高密度接种可加速肌管形成，但过度密集会导致接触抑制。培养基成分需精确配比，如添加鸡胚提取物可提供生长因子，而葡萄糖浓度需根据代谢需求调整。此外，培养环境需维持37℃、5%CO₂及饱和湿度，基质刚度通过机械力信号传导影响细胞形态与分化方向。
细胞间相互作用通过旁分泌信号与直接接触调控分化。成纤维细胞混杂会竞争营养并分泌抑制因子，差速贴壁法可有效纯化成肌细胞。共培养实验表明，心肌细胞微环境通过细胞间直接接触诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化，提示物理接触信号在分化调控中的主导作用。此外，细胞外基质成分（如胶原蛋白、纤连蛋白）通过整合素受体传递黏附信号，影响细胞骨架重排与分化基因表达。
